一、蛋白聚體形成的原因

結構不穩定、暴露疏水表面

蛋白本身結構不穩定或變性使疏水氨基酸暴露，與其他分子的疏水區域結合，促進聚集。

濃度過高

高濃度表達/純化狀態下，蛋白分子之間相互作用幾率增加，誘導聚集。

不適宜的pH與鹽離子強度

蛋白遠離等電點（pI）時帶電荷，極易因電荷中和/屏蔽而聚集。某些離子可穩定或破壞蛋白間作用。

氧化、化學修飾

半胱氨酸氧化，形成異常二硫鍵；甲硫氨酸、賴氨酸等被修飾，導致空間構象改變，進而聚集。

缺乏分子伴侶（chaperone）輔助折疊

原核、真核表達系統里，某些蛋白不易被正常折疊，誤折導致包涵體（聚體）形成。

溫度、剪切力等物理因素

劇烈震蕩、凍融、加熱均可造成蛋白變性和聚集。

長時間存放

蛋白隨時間發生構象變化，聚集逐漸形成不溶或非功能性聚體。

二、蛋白聚體的解決方法

1. 優化表達與折疊條件

降低誘導溫度：重組表達時（如大腸桿菌），降低誘導溫度（如16–25°C），減慢折疊過程，減少包涵體。

降低表達量：調控誘導劑（如IPTG）用量，不要“大量暴力表達”。

加入分子伴侶：如GroEL/GroES、DnaK等輔助折疊，防止錯誤聚集。

2. 純化過程優化

合理選擇緩沖液：包含適當的pH、鹽濃度、防止蛋白帶電中和（聚集往往在等電點附近加劇）；如Tris、PBS、HEPES等。

添加防止聚集劑：加入甘油、蔗糖、鹽（KCl、NaCl）、精氨酸、谷氨酸等常見穩定劑。

使用還原劑：如DTT、β-mercaptoethanol，防止二硫鍵異常交聯。

加分子穩定劑：比如Triton X-100、Tween-20等非離子型表面活性劑低濃度使用。

3. 結構與純度調整

點突變工程：針對疏水暴露、易聚集區，點突變為更親水的氨基酸，如將暴露的Leu/Val/Met改為Ser/Asp等。

融合標簽：如GST、MBP、SUMO等大標簽有助于提高蛋白溶解性，減少聚集。

分步純化/稀釋濃度：降低濃度、或分做小批量，每步都加穩定劑。

4. 存儲與處理改進

分裝凍存，避免多次凍融。

低溫保存（4°C/-80°C等），加甘油/蔗糖等保護劑。

避免劇烈攪動、強烈震蕩。

5. 重新折疊處理

對于已形成包涵體的蛋白：

用高濃度尿素/鹽酸胍變性，稀釋下逐步除去變性劑，緩慢復性。

結合稀釋、加入分子伴侶、小分子穩定劑等輔助復性。

三、實驗判定與優化流程

用**SEC（凝膠過濾/體積排阻層析）**或DLS（動態光散射）分析蛋白單體/聚體比例。

SDS-PAGE判定不溶蛋白聚集。

逐步調整上述方法，檢測蛋白活性與聚集比例。

小結：

蛋白聚體形成的主要原因是結構不穩定、疏水暴露、環境不適等，解決方法可通過表達參數優化、穩定劑添加、工程突變、適宜儲存等進行改善。具體步驟根據蛋白類型和應用場景調整。